【行業(yè)新聞】質(zhì)譜是怎樣做到定量的？

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時間：2017-09-28 12:05

注：這里的定量指的是待分析物的含量質(zhì)譜可以通過分子量信息定性（結(jié)構(gòu)），但根據(jù)我的理解，質(zhì)譜信號的強度是和離子化難易相關，并不能反應待分析物的含量（定量）

作者：胡墨

　　1. 質(zhì)譜信號強度與待分析物含量的關系

任何定量分析方法都需要建立實驗測量信號與待分析物的量的關系。很幸運的是，在質(zhì)譜中，通常也可以建立這樣的關系，因此質(zhì)譜信號是可以用于定量的。從題主的說明來看，Ta的疑惑主要在這里。既然問題是“質(zhì)譜是怎樣做到定量的？”，我們不妨把質(zhì)譜信號的產(chǎn)生按時間順序粗略分為三個步驟，即離子的產(chǎn)生，傳輸與檢測。

產(chǎn)生離子時，不同樣品分子的電離通常是相互獨立的。因此樣品量越多，其產(chǎn)生的離子也就越多。目前常用的各種離子化方法（EI、ICP、ESI、MALDI等）在實驗中（嚴格來說僅在一定濃度范圍內(nèi)——術(shù)語是動態(tài)范圍，dynamic range）都至少滿足樣品量與產(chǎn)生離子量的正相關，一般情況下也可以進一步近似成線性相關。

傳輸離子時，簡單來說可以認為傳輸效率與被傳輸離子的量無關；（嚴格地說，被傳輸?shù)碾x子太多時，相同電荷的互相排斥會造成離子束的“體積”變大，導致傳輸效率下降。這種影響在空間有限的離子阱中表現(xiàn)得更加明顯，因此在離子阱質(zhì)譜中一個重要的技術(shù)就是適當控制進入儀器的離子數(shù)量，使其既不太少也不太多。）

檢測離子時，不論是使用光電倍增管的檢測器，還是檢測鏡像電流的檢測器（ICR/Oribtrap），其信號強度（在一定范圍內(nèi)）均與離子數(shù)量大致線性相關。

廢話幾句，可能會使題主感覺質(zhì)譜不能定量的原因之一是，我們看到的質(zhì)譜圖常用相對強度作為縱坐標，即0-100%最強峰，而不展示信號的絕對強度。但在做質(zhì)譜的時候，儀器記錄的當然是絕對強度（相對強度也是通過絕對強度換算出來的）。我們需要用絕對強度來定量時，就需要這部分平時不?？吹男畔⒘恕?/p>

另外，在談到色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法時，待分析物與實驗測量信號的關系之中又多了一層色譜，即待分析物含量->色譜流出物中樣品含量->質(zhì)譜信號。與EI譜圖分析以相對強度為主不同，在色譜-質(zhì)譜聯(lián)用時，信號的絕對強度就成了我們天天都要關心的內(nèi)容，因為質(zhì)譜信號強度隨時間的變化就是實驗的色譜圖，通常以總離子強度或者某一特定質(zhì)荷比離子的強度作圖。

2. 定量的兩種方法

說過了為什么質(zhì)譜可以定量，下面我們來看看具體的定量方法。常用的定量方法有兩種，外標法與內(nèi)標法。

外標法

用已知量的標準樣品A和未知量的待測樣品A分別進行實驗；我們會得到以下三個信息：標準樣品的量（已知）；標準樣品的信號強度；待測樣品的信號強度。（假設樣品的響應=常數(shù)*濃度，從這三個信息即可算出待測樣品的量。）

為了更加精確地測定未知量的樣品，我們希望標準樣品的信號強度與待測樣品的信號強度盡量接近（以減少非線性響應的影響）。因此常用的外標法會測量一系列已知量的標準樣品，繪制一條工作曲線，再用擬合的方法確定未知樣的量。

內(nèi)標法

外標法主要有以下兩方面的局限：1標樣和待測樣是獨立進行實驗的，實驗間的偶然誤差無法消除；2標樣和待測樣的基質(zhì)（即除待分析物外的其它成分）不同，基質(zhì)有可能會帶來不同的影響，也會產(chǎn)生誤差。

那么，如果我們把已知量的標準樣品B直接加入待測樣品A，就可以把標準樣品和未知樣品的測定在同一次實驗和同樣基質(zhì)中完成，也就消除了兩次實驗和基質(zhì)不同造成的誤差，這就是內(nèi)標法。（如果加入的標準樣品和待測樣品是同種物質(zhì)A，那么由于它們不可區(qū)分，只通過一次實驗是不能定量待測樣的，這時我們在加入標樣前后分別進行兩次測量，即測量待測樣及待測樣+標樣的信號，即可計算出待測樣的量。）

3. 質(zhì)譜相關的特殊定量細節(jié)

同位素稀釋

前面內(nèi)標法的介紹中我們可以發(fā)現(xiàn)，最理想的內(nèi)標物既要和待測樣相同（具有相同的響應系數(shù)）又要不同（儀器可以區(qū)分二者的信號），這對矛盾的集合體就是同位素內(nèi)標。

由于不同同位素的化合物具有近似相同的物理化學性質(zhì)，離子化時的響應通常也是相同的，而它們具有不同的質(zhì)荷比m/z，即可在質(zhì)譜中被區(qū)分出來。因此同位素標準品是最理想的內(nèi)標物。

另外，由于某些元素的天然同位素分布有一定的比例，當我們加入一定量的同位素內(nèi)標時，可以把對信號絕對強度的測量轉(zhuǎn)化為對信號相對比例的測量，從而提高實驗的準確性。

選擇反應監(jiān)測

在不太復雜的體系中，我們只要按照分子量就可以定性某種化合物了。但對于復雜混合物（如石油產(chǎn)品/生物樣品）而言，很多化合物具有相同或相近的質(zhì)量（同分異構(gòu)體質(zhì)量完全相同，有些化合物分子量非常接近，如CO和N2，要考慮儀器的質(zhì)量分辨率是否能區(qū)分二者），此時僅靠測量質(zhì)量就不能確定這個化合物是否就是我們關心的“the one”了。

在串聯(lián)質(zhì)譜 (Tandem MS) 儀器中，我們不僅可以把質(zhì)譜儀理解為一個稱量離子的“天平”，它還具有了離子“鑷子”（選擇某個特定的離子把它分離出來）和“剪刀”（把某個/某些離子激活并打成碎片）的功能。

通過母離子和子離子的兩步選擇，我們可以在復雜體系中精確定位到我們關心的化合物，同時，兩次離子選擇還可減少復雜基質(zhì)的干擾，降低背景噪聲（獲得更低的檢出限）并提高方法的動態(tài)范圍。因此選擇反應監(jiān)測是目前色譜（氣相色譜/液相色譜）-質(zhì)譜聯(lián)用中最常用的定量方法。

致謝和補充閱讀：第一幅圖是自己的數(shù)據(jù)；后面幾幅圖來自Wikipedia，CC BY-SA 3.0(Creative Commons)Wikipedia (英語): Standard curve, Isotope dilution, Selected reaction monitoring

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