熒光定量PCR操作步驟
熒光定量PCR是1996 年由美國(guó)Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗(yàn)技能，它是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)記盯梢，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件能夠?qū)Ξa(chǎn)品進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。
熒光定量PCR原理
PCR擴(kuò)增時(shí)在參加一對(duì)引物的一起參加一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩頭分別標(biāo)記一個(gè)陳述熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，陳述基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開(kāi)始時(shí), 探針結(jié)合在DNA恣意一條單鏈上;PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使陳述熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)別離，然后熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，完成了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)品形成徹底同步?；蛘哌\(yùn)用熒光染料SYBR。SYBR能夠結(jié)合到雙鏈DNA上面，當(dāng)系統(tǒng)中的模板被擴(kuò)增時(shí)，SYBR能夠有用結(jié)合到新組成的雙鏈上面，跟著PCR的進(jìn)行，結(jié)合的SYBR燃料越來(lái)越多，被儀器檢測(cè)到的熒光信號(hào)越來(lái)越強(qiáng)，然后到達(dá)定量的意圖。
熒光定量PCR試驗(yàn)過(guò)程：
樣品RNA的抽提
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其徹底溶解。
②兩相別離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中參加0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振動(dòng)管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為基層的紅色酚氯仿相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)參加的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉積 將水相上層轉(zhuǎn)移到一潔凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉積其間的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉積將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉積塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中參加至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O制造），清洗RNA沉積。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 當(dāng)心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉積在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉積 溶解RNA時(shí)，先參加無(wú)RNA酶的水40μl用槍重復(fù)吹打幾次，使其徹底溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
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