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自動(dòng)DNA合成儀的操作要點(diǎn)及故障排除介紹

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時(shí)間:2019-01-16 11:37:41

自動(dòng)DNA合成儀的操作要點(diǎn)及故障排除介紹


自動(dòng)DNA合成儀的操作要點(diǎn):


1.合成開始后檢查要點(diǎn)

合成開始時(shí),檢查第二個(gè)核苷酸脫DMT所產(chǎn)生的橘色,保證一切正常。*個(gè)DMT的顏色不能作為提供資料的依據(jù),因?yàn)樗禽d體上裝進(jìn)的*個(gè)核苷的量度。檢查合成柱是否滲漏,滲漏原因可能是由于柱子錯(cuò)誤或柱子與合成儀上的luer接頭未擰緊所致。檢查監(jiān)視器上的詳細(xì)內(nèi)容,必要時(shí)重新存儲所需參數(shù)。


2.自動(dòng)DNA合成儀上試劑的穩(wěn)定性

無論合成進(jìn)行到什么程度,試劑管道中的單體每幾分鐘就需要補(bǔ)充一次,不會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的亞磷酰胺分解。但是如果儀器已經(jīng)1h以上未運(yùn)行,在合成開始前必須清洗試劑管路,除去管內(nèi)分解的試劑。即使在zui好的條件下,試劑的壽命也是有限的,因此,要將在合成儀上存放2周以上的試劑棄去;對于合成30個(gè)堿基12 1-_的寡核苷酸,應(yīng)用的亞磷酰胺和四唑在合成儀上的時(shí)間應(yīng)短于一周。對于合成50mer或更長的寡核苷酸,應(yīng)該用新鮮的亞磷酰胺、四唑和乙腈。


3.自動(dòng)DNA合成儀上的試劑更換

在某一合成期間任何一種試劑用完都會(huì)導(dǎo)致合成失敗,所以在合成前必須檢查所有儲液瓶內(nèi)的試劑量。如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度降至18~C以下,需要用電吹風(fēng)溫?zé)醿σ浩?,使某些結(jié)晶溶解。如果一個(gè)位置配有一個(gè)一次性的瓶塞,當(dāng)新瓶子放到合成儀上時(shí),要檢查并更換瓶塞。任何裂開的瓶塞都不能使用,*性的瓶塞也要檢查。另外,要檢查試劑瓶口邊緣是否有缺口,缺口瓶在合成儀上塞不緊,不能輸送試劑。


4.合成中更換試劑瓶

在特定循環(huán)上單體縮合、封閉、氧化完成后,等待用乙腈清洗,并中斷循環(huán)和三個(gè)柱。然后按正常方法換瓶,取消所有中斷信息,重新開始合成,千萬不要讓合成中斷超過lmin,這樣會(huì)使偶聯(lián)率下降或造成合成失敗。 






自動(dòng)DNA合成儀儀器的故障排除:


化學(xué)合成方法與生物化學(xué)方法之間有著顯著的差別,材料和方法上非常小的改變常常會(huì)在所獲得的產(chǎn)物以及保證可靠的合成路線之間造成差別。下面介紹幾個(gè)zui可能引起故障的經(jīng)驗(yàn)問題。

1.溶劑

大多數(shù)用在化學(xué)合成中的商品試劑都不夠純。因此使用前應(yīng)該進(jìn)行純化(常用方法:蒸餾)。對于“專為合成DNA純度”的溶劑也要檢查其顏色(幾乎所有的液體都是無色的)及透明度(顆粒將阻塞多孔玻璃,分子篩塵埃將造成合成失?。?。大多數(shù)有關(guān)的雜質(zhì)是水、酸、堿和金屬離子。

水:對吸收水的化學(xué)試劑蒸餾一次,大多數(shù)溶劑的水分將會(huì)減少到10btg/g或更少。因?yàn)樵谂悸?lián)步驟中允許少量水的存在,故這種水分含量的溶劑可用于合成。許多溶劑都是吸潮的,因此所有溶劑的容器都應(yīng)該塞緊,只能短時(shí)打開,通常沒有必要在氬氣中儲存。

酸和堿:氯化的碳?xì)浠衔锍:形⒘葵}酸,在合成期間會(huì)使二甲氧基三苯甲基損失。通過下列方法可以進(jìn)行檢測:在5ml溶劑中溶解lmg的5,—O—二甲氧基三苯甲基脫氧核糖核苷酸衍生物,測定495nm處的吸收值,應(yīng)該沒有吸收。極性溶劑中的一級和二級氨能切斷寡核苷酸與載體之間的鍵,可以用茚三酮試驗(yàn)檢測。

金屬離子:雖然溶劑中沒有這一問題,但作為干燥劑的分子篩含有大量的鐵。有些溶劑從分子篩中濾出三價(jià)鐵離子,這種分子篩與DNA鍵合,引起堿基修飾和核苷酸間的切除。其他金屬離子可能也是有害的。

2.試劑

DNA合成時(shí),脫氧核糖核苷單體中小量的高反應(yīng)活性的雜質(zhì)造成的影響非常大。應(yīng)用大量過量單體,擴(kuò)大了雜質(zhì)的影響。檢測比較困難,但應(yīng)該引起高度注意。在催化劑、偶聯(lián)劑和脫保護(hù)劑中的雜質(zhì)一般影響較小。

3.儀器

DNA合成可以用很多不同類型的儀器進(jìn)行,總的原則是既能應(yīng)用于磷酰二酯法,也可用于亞磷酰胺三酯法。儀器一般分為4種類型:手動(dòng)、半手動(dòng)、半自動(dòng)化和自動(dòng)化(DNA合成儀)。DNA合成儀減少了合成所需的手工勞動(dòng),但是儀器并不能取代人,機(jī)器的錯(cuò)誤是隨著儀器本身的檢察能力而變化的。甚至高級的儀器都還沒有能夠準(zhǔn)確地分析一個(gè)合成的成功與否或者根據(jù)提供的信息作調(diào)整的“反饋控制”。因此儀器并不是真正的“自動(dòng)”(注意:測量釋放的DMT基團(tuán)僅僅是一種機(jī)械的檢查,對可獲得的產(chǎn)物量不是可靠的指導(dǎo),只是對鏈擴(kuò)增的效率有指導(dǎo)作用)。總之,無論選擇哪種類型的儀器,接觸溶劑的部分zui好選用玻璃或是聚四氟乙烯材料。 




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