手性分析之流動(dòng)相方法優(yōu)化
1、 流動(dòng)相
手性分析很關(guān)鍵的一項(xiàng)是流動(dòng)相的選擇，手性分析一般都采用正相，使用最多的流動(dòng)相是正己烷、正庚烷、乙醇和異丙醇這四種，其中起洗脫作用的流動(dòng)相是乙醇和異丙醇，正己烷和正庚烷用來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度。正己烷和正庚烷對(duì)于樣品分離沒有什么太大的影響，不會(huì)改變選擇性和分離度，通常都可以混用，不過正庚烷比正己烷對(duì)人體的傷害要小很多，但價(jià)格是后者的一倍，所以歐美的很多大制藥公司多使用正庚烷，而國內(nèi)多使用正己烷。乙醇和異丙醇對(duì)樣品的分離起關(guān)鍵的作用，不同的醇有不同的選擇性，改變醇的種類可以改變選擇性，常用的醇類是乙醇和異丙醇，甲醇不能使用是因?yàn)樗驼和?、正庚烷不互溶，叔丁醇粘度太大，一般作為添加劑配合乙醇或者異丙醇少量使用，提供特殊的選擇性，通常能起到意想不到的效果。一般情況下分析手性樣品，很多人推薦首選異丙醇，因?yàn)橐掖細(xì)馕侗犬惐己靡稽c(diǎn)，且乙醇做流動(dòng)相壓力要低一些，實(shí)際上二者差別不是太大。
流動(dòng)相里經(jīng)常需要添加酸或者是堿來調(diào)節(jié)峰形，常用的酸有、乙酸和甲基磺酸，堿一般是二乙胺和三乙胺，也有用乙醇胺和異丁胺的，流動(dòng)相里添加酸和堿的濃度一般要求控制在0.2%(體積比)以下，我們一般用0.1%，使用的原則一般是酸性樣品加酸，堿性樣品加堿，但實(shí)際上很多樣品是即含酸性基團(tuán)又含堿性基團(tuán)，這就要看哪個(gè)基團(tuán)作用強(qiáng)了，對(duì)于某些含氨基的兩性樣品，例如苯甘氨酸，甲基磺酸是一個(gè)非常好的選擇，磺酸基能夠抑制氨基的堿性，又能提供一個(gè)酸性的流動(dòng)相環(huán)境，使樣品既能得到很好的分離又能獲得對(duì)稱的峰形。
一般做純度分析檢測(cè)雜質(zhì)含量時(shí)我們要求盡量的采用低波長來讓盡可能多的雜質(zhì)有紫外吸收，而做手性分析時(shí)我們需要采用盡可能高的波長來去除在低波長下才有吸收的雜質(zhì)的干擾，一般原則還是盡量選擇樣品紫外吸收最好的地方來獲得較高的靈敏度，但流動(dòng)相里添加二乙胺會(huì)導(dǎo)致在低波長下基線波動(dòng)變大，系統(tǒng)難以平衡，這種情況下一般要提高檢測(cè)波長，實(shí)際操作過程中有些樣品在高波長下吸收非常差，只能用低波長檢測(cè)，這樣的樣品可以嘗試在樣品稀釋的時(shí)候加入過量的二乙胺(但不宜太多)，而流動(dòng)相用中性，從而獲得滿意的分析結(jié)果。有些樣品只添加堿或者酸效果不好，可以嘗試在樣品里同時(shí)添加酸或者堿，這種情況下通過酸堿同時(shí)加入，最后獲得了非常漂亮的峰形和良好的分離度。實(shí)際操作中有些樣品堿性太強(qiáng)，進(jìn)樣以后根本不成峰，低波長下細(xì)看似乎能感覺到基線一直在漂，開始時(shí)懷疑樣品濃度不夠，加大樣品濃度以后仍看不到樣品峰，流動(dòng)相加入二乙胺或三乙胺以后再進(jìn)樣，得到比較漂亮的樣品峰。
流動(dòng)相里添加酸或者堿以后，基本上不會(huì)提供額外的選擇性，但是卻能提高分離度，因?yàn)榉逍魏昧?，相同的保留時(shí)間兩個(gè)峰之間的分離度自然就好了。但是流動(dòng)相里添加酸或者堿以后，會(huì)在柱子上殘留，即使長時(shí)間用中性流動(dòng)相沖洗也不會(huì)有什么效果，這一點(diǎn)在鍵合相手性柱上表現(xiàn)的尤為明顯。有時(shí)我們發(fā)現(xiàn)原來用中性流動(dòng)相分離很好的一個(gè)偏酸性的樣品，柱子用過堿性流動(dòng)相以后再用中性流動(dòng)相去做，發(fā)現(xiàn)樣品峰不能達(dá)到基線分離，拖尾嚴(yán)重，甚至不成峰，這時(shí)可以往流動(dòng)相里添加一滴酸，或者柱子用酸性流動(dòng)相沖洗一下再用中性的流動(dòng)相，一切又正常了，同理，用過酸性流動(dòng)相的柱子去做弱堿性的樣品會(huì)有一樣的問題。殘留在柱子上的酸或堿最好是用堿或酸性的流動(dòng)相來清洗，有條件的話盡量固定一只柱子只用酸性流動(dòng)相或只用堿性流動(dòng)相。
2、 方法優(yōu)化
做手性分析時(shí)一般選用兩只柱子：AD-H和IC，基本上這兩只柱子可以解決遇到的所有的手性化合物，AD-H是早期我們一直在使用的，后來的IC 可以使用更多的溶劑從而提供了更多的選擇性，但是習(xí)慣先用AD-H做手性分析方法開發(fā)，手性分析基本上都用恒流來做，溶劑一般也都是提前混合好再放到儀器上用，主要是因?yàn)檎嗳軇┰趦x器上混合效果不好。
如前邊所述，一般情況下拿到一個(gè)樣品，首先選擇的是用正己烷和乙醇做流動(dòng)相，根據(jù)化合物分子結(jié)構(gòu)式來判斷其極性的大小，進(jìn)而來選擇流動(dòng)相的比例，極性大的選擇使用的乙醇比例大一點(diǎn)，極性小的選擇使用的乙醇比例小一點(diǎn)，乙醇比例一般是從大到小，根據(jù)分離情況以5%或10%的比例遞減，一般要求第一針至少能把樣品在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)從柱子上洗脫下來，然后再去做調(diào)整，如果開始的時(shí)候醇的比例選的過小，樣品可能在柱子上一兩個(gè)小時(shí)都洗不下來。消旋體出峰以后如果是一個(gè)峰，可以將峰放大，觀察有沒有分叉的跡象，有的話，可以通過適當(dāng)?shù)慕档痛碱惖谋壤齺磉M(jìn)一步提高分離度，如果分得太開，可以適當(dāng)?shù)奶岣叽碱惖谋壤齺砜s短分析時(shí)間，通過對(duì)流動(dòng)相比例的調(diào)整，使分析時(shí)間和分離度都能滿足手性分析的要求。如果樣品在使用一種醇類時(shí)沒有選擇性，即無論怎樣減小醇的比例樣品都沒有分離的跡象，可以換一種醇來試，通常乙醇和異丙醇會(huì)有不同的選擇性，很多樣品乙醇分不開，異丙醇能分離的很好。異丙醇也不行的時(shí)候可以嘗試在乙醇或者異丙醇里加入合適濃度的叔丁醇或者是甲醇，對(duì)于IC色譜柱可以嘗試其它如二氯甲烷、乙酸乙酯和甲苯等其它溶劑，每一種溶劑都能為手性分析提供獨(dú)特的選擇性，一般除了乙醇、異丙醇之外我使用最多的還是叔丁醇，其次是甲醇，叔丁醇可以單獨(dú)和正己烷做流動(dòng)相，甲醇必須結(jié)合乙醇或異丙醇混合使用。需要著重強(qiáng)調(diào)的是，更換醇的種類，有可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)映異構(gòu)體出峰順序的改變，使用乙醇的流動(dòng)相，如果R構(gòu)型先出峰，更換為異丙醇以后，有可能(不是一定)R構(gòu)型會(huì)后出峰，S構(gòu)型跑到前邊去了。
雖然提高柱溫能夠使峰形變窄變細(xì)，但是會(huì)降低分離度，而且大賽璐的手性柱溫度上限就是40度(這一點(diǎn)在超臨界流體色譜應(yīng)用上受限尤為明顯)，所以優(yōu)化分析方法時(shí)很少有人在柱溫上下功夫。另外手性柱分析樣品的保留時(shí)間受室溫變化的影響特別大，通常大家都習(xí)慣用消旋體圖譜計(jì)算對(duì)映異構(gòu)體相對(duì)保留時(shí)間的方法根據(jù)主峰的保留時(shí)間來計(jì)算異構(gòu)體的出峰位置。
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