色譜常見問題（3）-高效液相色譜實驗技術(shù)問題解答
1、高效液相色譜是如何實現(xiàn)高效、快速、靈敏的?
解：氣相色譜理論和技術(shù)上的成就為液相色譜的發(fā)展創(chuàng)造條件，從它的高效、高速和高靈敏渡得到啟發(fā)，采用5一10四微粒出定相以提高柱效，采用高壓泵加快液體流動相的流速;設(shè)計高靈敏度、死體積小的紫外、熒光等檢測器，提高檢測靈敏度，克服經(jīng)典液相色譜曲缺點，從而達(dá)到高效、快速、靈敏。
2、與氣相色譜法相比高效液相色譜有哪些優(yōu)點和不足?
解：氣相色譜的分析對象是在校溫下具有一定的揮發(fā)性、對熱穩(wěn)定購物質(zhì)。因此它只限于分析氣體和沸點低的化合物或揮發(fā)性的衍生物。而高效液相色譜由于以液體作為流動相，只要被分析的物質(zhì)在選用的流動相中有一定的按解度，便可以分析，所以適用性廣，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，特別適合于那些沸點高、極性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性差的化合物，例如，生化物質(zhì)和藥物、離子型化合物、熱穩(wěn)定性差的天然產(chǎn)物等。在目前已知的有機(jī)化臺物中， 只有20%樣品可不經(jīng)化學(xué)處理而能滿意地用氣相色譜分離，80%的有機(jī)化合物要用高效液相色譜分析。 氣相色譜中流動相是惰性的，它對組分沒有作用力，僅起運載作用、而高效液相色譜的流動相不僅起運載作用，而且流動相對組分有一定親合力，可以通過改變流動相種類和組成提高分離的選擇性，另外可作流動相的化合物多，選擇余地廣。 與氣相色譜相比，高效液相色譜的另一個優(yōu)點是樣品的回收比較容易，只要開口容器放在柱子末端，就可以很容易地將所分離的各組分收集。回收是定量的，可以用來提純和制備具有足夠純度的單一物質(zhì)。高效液相色譜不足的是，日前檢測器的靈敏度不及氣相色譜。必須特別注意“柱外效應(yīng)”對柱效率及色譜分離的影響。
3、試比較氣相色譜與液相色譜的H-u曲線，分析產(chǎn)生不同的原因？
解：從圖可看出，氣相色譜和液相色譜得到的H-u曲線，形狀迥然不同，流動相的流速對柱效的影響也不一樣，在氣相色譜的H-u曲線上，塔板高度H隨u變化呈雙曲線.曲線有一最低點，這時柱效最高，板高最小，流速最佳。而液相色譜H-u曲線，未出現(xiàn)流速降低板高增加的現(xiàn)象，由于最佳流速趨近于零，一般觀察不到最低板高相對應(yīng)的最佳流速。在正常的情況下，流速降低，板高H總是降低的，這與氣相色譜明顯不同。在氣相色譜中流動相流速增大，柱效呈直線降低，而在液相色譜中，流動相流速增大，柱效平緩降低。其主要原因是液相色譜的流動相為液體，液相的擴(kuò)散系數(shù)Dm很小，通常僅為氣相擴(kuò)散系數(shù)的104~105
分之一，所以分子擴(kuò)散項在低u時也不起多大作用、因此液相色譜H-u曲線未能出現(xiàn)流速降低，板高增加現(xiàn)象。到高速時，雖然柱內(nèi)線速提高，但固定相和流動相的傳質(zhì)都能很快進(jìn)行，故H-u曲線上升緩慢。
4、簡述液相色譜中引起色譜峰擴(kuò)展的主要因素，如何減少諳帶擴(kuò)張、提高柱效?
解：液相色譜中引起色諾峰擴(kuò)展的主要因素為渦流擴(kuò)散、流動相傳質(zhì)、停留流動相傳質(zhì)及柱外效應(yīng)。在液相色譜中要減小譜帶擴(kuò)張，提高柱效，要減少續(xù)料顆粒直徑，減小境料孔穴深度，提高裝填的均勻性，采用低粘度溶劑作流動相，流速盡可能低，同時要盡可能采用死體積較小的進(jìn)樣器、檢測器、接頭和傳輸管線等。
5、為什么要提出折合參數(shù)?有何特點?
解：我們知道色譜操作條件對板高是有影響的.Giddings發(fā)現(xiàn)，固定相相同，填充良好，共是粒度dp不同，因而H-u曲線不同，在液相色譜中，培板高度是粒度的函數(shù)，為了比較不向色譜條件下的板高H.提出折合參數(shù)，包括折合板高、折合流速、折合柱長。其特點是對于不同粒度的填料能得到相同的H—ur 曲線，因此可以在相同的條件下比較不同填料的柱效。
6、色譜柱A長度為15cm，載體粒度為5m.另一B柱長為30cm，載體粒度為10m，兩柱的柱效相等嗎?
解：A柱的折合柱長為30000，B柱的折合柱長也為30000，表明組分在兩根柱內(nèi)從柱人口到出口都經(jīng)過30000個載體顆粒.兩校的柱效相等。
7、何謂梯度淋洗，適用于哪些樣品的分析?與程序升溫有什么不同?
解：梯度淋洗就是在分離過程中.讓流動相的組成、極性、pH值等按‘定程序連續(xù)變化。使樣品中各組分能在最佳的k下出峰。使保留時間短、擁擠不堪、甚至重疊的組分，保留時間過長而峰形扁平的組分獲得很好的分離，特別適合樣品中組分的k值范圍很寬的復(fù)雜樣品的分析。梯度淋洗十分類似氣相色譜的程序升溫，兩者的目的相同。不同的是程序升溫是通過程序改變柱溫。而液相色譜是通過改變流動相組成、極性、pH值來達(dá)到改變k的目的。
8、流動相為什么要預(yù)先脫氣?常用的脫氣方法有哪幾種?
解：流動相中溶解氣體存在以下幾個方面的害處，氣泡進(jìn)入檢測器，引起光吸收成電信號的變化，基線突然跳動，干擾檢測;溶解在溶劑中的氣體進(jìn)入色譜柱時，可能與流動相或固定相發(fā)生化學(xué)反應(yīng);溶解氣體還會引起某些樣品的氧化降解.對分離和分析結(jié)果帶來誤差。因此，使用前必須進(jìn)行脫氣處理。常用的脫氣法有以下幾種：（1）加熱脫氣法;（2）抽吸脫氣法;（3）吹氦脫氣法;（4）超聲波振蕩脫氣法。
9、按固定相孔徑大小分類，液相色譜固定相有哪幾類?各有什么特性及適用范圍?
解：從固定相的孔隙深度考慮，液相色譜固定相分為表面多孔型（薄殼型）和全多孔型（全孔型）兩類。表面多孔型固定相多孔層厚度小.孔淺，相對死體積小，出峰迅速，柱效高，顆粒較大，滲透性好，由于孔淺，梯度淋洗時，當(dāng)流動相成分改變后.孔內(nèi)外流動相成分能迅速達(dá)到平衡，機(jī)械強(qiáng)度高，裝柱容易，其不足的是由于多孔層厚度小，因而柱容量小，最大允許樣品量受到限制，適用于比較簡單的樣品分析及快速分析。全多孔型固定相，由于顆粒很細(xì)，孔仍然很淺.傳質(zhì)速度較快，柱效高。梯度淋洗時孔內(nèi)外流動相成分的平衡速度仍然較快.其最大特點是柱容量大，最大允許樣品量是表面多孔型的5倍，但裝填的什于滲透性低，因而需要更高的操作壓力.制柱比表面多孔型的難。這種固定相特別有利于痕量組分及多組分復(fù)雜混合物的分離分析。
10、什么叫化學(xué)鍵合色譜? 與液—液色譜相比有何優(yōu)點?
解：通過化學(xué)反應(yīng)，將固定液鍵合到載體表面，此種固定相稱為化學(xué)鍵合固定相;采用化學(xué)鍵合固定相的色譜法，稱為化學(xué)鍵合色譜。
與液—液分配色譜相比，鍵合色譜法的主要優(yōu)點：（1）化學(xué)鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用過程中不流失。（2）適宜用梯度淋洗。（3）適合于k范圍很寬的樣品。（4）由于鍵合到載體表面官能團(tuán)，既可是非極性的，也可是極性的，因此應(yīng)用面廣。
11、（選擇題）在液相色譜中，常用作固定相合相基體的物質(zhì)是？
A.分子篩 B.硅膠 c氧化鋁 D.活性炭
解：B.硅膠。
要形成化學(xué)鍵合固定相，所用的基質(zhì)材料應(yīng)有某種化學(xué)反應(yīng)活性，在四種固體固定相中只有硅膠合有硅醇基，是能進(jìn)行鍵合的活性官能團(tuán)。
12、高效液相色譜柱有哪幾種類型? 細(xì)徑柱有什么優(yōu)點?
解：高效液相色譜拄大致可分為三種類型：內(nèi)徑小于2mm的稱為細(xì)管徑或微管徑柱;內(nèi)徑在2~5mm范圍內(nèi)的是常規(guī)高效液相色譜柱;內(nèi)徑大于5mm的一般稱為半制備柱或制備柱。細(xì)管徑柱的主要優(yōu)點是：（1）分離效能高。（2）流動相最佳流速低，消耗量少。（3）可采用多種檢測器，便于聯(lián)用（CLC MS，CLC-FTIR）。（4）采用細(xì)而短的毛細(xì)管柱可以提高分析速度，實現(xiàn)快速分析。
13、什么叫反相色譜?試從固定相、流動相、流出次序、流動相極性的影響等幾個方面比較正相和反相的區(qū)別？
解：流動相的極性比固定相的極性強(qiáng)的色譜體系叫反相色譜。例如以十八烷基硅膠鍵合相（ODS）為固定相，以甲酵/水作流動相，是典型的反相色譜。
14、對液相色譜流動相有何要求?
解：用作液相色譜流動相的溶劑，其純度和化學(xué)特性必須滿足色譜過程中穩(wěn)定性和重復(fù)性的要求。對樣品要有一定的溶解能力，粘度小，化學(xué)穩(wěn)定性好，避免發(fā)生不可逆的化學(xué)吸附。溶劑應(yīng)與檢測器相匹配，不干涉所使用檢測器的工作，制備色譜的溶劑應(yīng)不干擾對分離各組分的回收。除此以外，選擇的溶劑對所給定的樣品組分具有合適的極性和良好的選擇性。
15、在150×2mm硅膠柱流動相為已烷/甲醇（150：2），紫外檢測器色譜條件下分離丙烯酰胺，判斷以下組分的出峰次序，為什么?
解：在給定的色譜條件下，組分B先出峰，組分A后出峰。以硅膠為固定相，己烷/甲醇（150：2）為流動相，該體系為正相色譜，樣品的極性A>B，在正相色譜體系極性小的組分先出峰，極性大的組分后出峰，所以出峰次序為B先出，A后出。
16、在硅膠往上，用甲苯為流動相，某組分的保留時間為30min，如果改用四氯化碳或乙醚為流動相，試指出選用哪一種溶劑能減少該組分的保留時間? 為什么?
解：該體系為正向色譜體系。在該體系中流動相的極性增大保留值減小。流動相甲苯、四氯化碳及乙醚的溶劑強(qiáng)度參數(shù)分別是0.29、0.18、0.38，因此選用溶劑強(qiáng)度參數(shù)大于甲苯的乙醚，可縮短該化合物的保留時間。
17、在高效液相色譜中，組分和溶劑分子之間存在哪幾種作用力?
解：存在色散力、偶極作用、氫鍵作用和介電作用等四種作用力。
18、什么是溶劑極性參數(shù)與溶劑強(qiáng)度? 它們之間的關(guān)系如何?
解：溶劑分子與溶質(zhì)分子以色散力、偶極作用力、氫鍵作用力及介電作用力四種方式進(jìn)行相互作用的能力稱為分子的“極性”，溶劑的這種能力以溶劑極性參數(shù)P’表示，P’值越大，溶劑的極性越強(qiáng)。溶劑強(qiáng)度指用作流動相的溶劑，將組分從色譜柱上洗脫下來的能力。溶劑強(qiáng)度直接與溶劑的極性有關(guān)，而且隨不同色譜體系而變，在正相色譜體系中，溶劑極性增加，使組分從柱上洗脫下來的能力增加，即P’越大的溶劑，溶劑強(qiáng)度越大。在反相色譜中，溶劑極性減小，使組分從柱上洗脫下來的能力增加，即P’越小的溶劑，溶劑強(qiáng)度越大。
19、預(yù)測在正相色譜與反相色譜體系中，組分的出峰次序？
解：在正相色譜體系中組分的出峰次序為：極性弱的組分，在流動相中溶解度較大，因此k值小，先出峰。極性強(qiáng)的組分，在固定相中的溶解度較大，因此k值大，后出峰。 在反相色譜中組分的出峰次序為：極性弱的組分在固定相上的溶解度大，k值大，后出峰，相反極性強(qiáng)的組分在流動相中溶解度大，k值小，所以先出峰。
20、在ODS固定相上，以甲醇為流動相，某組分的分配容量k1=1.2，如以乙腈為流動相，其k增加還是減少? 為什么?
解：據(jù)題意為反相色譜體系。
k值增加，在反相色譜體系中，流動相由甲醇變?yōu)橐译?，溶劑極性參數(shù)由5.1變?yōu)?.8，增加了，但組分在流動相中的溶解度反而減小，所以k值增大。由1.2增大為2.24。
21、在反相色譜中，流動相從40%（V/V）甲醇—水改變?yōu)?0%（V/V）甲醇—水，問組分的調(diào)整保留值將改變多少? 為什么? （P’ 甲醇=5.1，P’ 水=5.1）
提示：對于由溶劑A和B組成的二元混合溶劑，其極性可表示為
Pab ‘=a P a’ + b P b’
式中a和b分別為溶劑A和B在混合溶劑中的分?jǐn)?shù)。
解：在40%配比時，混合溶劑的極性為
P1’ =0.46×5.1+0.6×10.2=8.16
在60%配比時，混合溶劑的極性為
P2’ =0.6×5.1+0.4×10.2=7.14
P2’= P2’- P2’=7.14-8.16= -1.02
根據(jù)反相色譜體系
∴在反相色譜中，流動相的極性變?nèi)酰≒’由8.16變?yōu)?.14），溶劑強(qiáng)度增加，洗脫能力增加，因而使組分的調(diào)整保留時間減少到原來的1/3.2。
22、某色譜體系采用25%三氯甲烷/正己烷為流動相，發(fā)現(xiàn)組分分離不十分理想，想通過改變流動相的選擇性來改善分離選擇性，選用乙醚/正己烷為流動相，問乙醚/正己烷的比例為多少? （P’ CHCl3=5.1，P’乙醚=5.1）
解：25%的CHCl3/正己烷與37%乙醚/正己烷的溶劑強(qiáng)度相等，但對樣品的分離選鋒性不同。
23、什么叫離子色譜?
解：在低交換容量的分離柱上，分離樣品離子，而在高交換容量的抑制柱上，通過化學(xué)反應(yīng)，把具有高電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變?yōu)榈碗妼?dǎo)的流動相，這樣就可以在電導(dǎo)檢測器上對被分離樣品離子進(jìn)行高靈敏度的檢測。這種采用分離柱、抑制柱和電導(dǎo)檢測器相結(jié)合的離子交換色譜稱為離子色譜。
24、為什么凝膠色譜中任何組分的分配系數(shù)必須符合0≤K≤1?如果K>l說明什么問題?
解：因為組分的分配系數(shù)為K=Cs/Cm ，C s與Cm分別為組分在固定相和流動相中的濃度，當(dāng)分子直徑大于固定相孔徑時，此時Cm=0，∴K=0。當(dāng)分子直徑小于孔徑時，組分向孔隙內(nèi)流動相擴(kuò)散，達(dá)到平衡時，一半組分在孔隙內(nèi)，一半在孔隙外，此時K=1.0，若分子直徑介于以上兩種極限情況之間，K一定介于0與1之間.可見在凝膠色譜中，任何組分的分配系數(shù)為0≤K≤1，如果K>1，這說明此時的分離方式已不是純粹的凝膠色譜，其分離過程受到其他作用力（如吸附）的支配。
25、某人用凝膠色譜分離一高聚物樣品，分離情況很差，他改變流動相的組成后，分離情況大為改進(jìn)，這種說法對嗎? 為什么?
解：這種說法不對。在凝膠色譜中流動相只起運載的作用，不能依靠改變流動相的性質(zhì)和組成來改善色譜體系的選擇性。凝膠色譜的選擇性只能通過選擇合適的固定相，根據(jù)固定相孔隙的大小以及孔徑分布范圍的最佳化來實現(xiàn)。題目中“改變流動相組成后，分離情況大為改進(jìn)”是不可能的。
26、為了測定鄰氨基苯酚中微量雜質(zhì)苯氨，現(xiàn)有下列固定相：硅膠、ODS鍵合相，下列流動相：水—甲醇、異丙醚—己烷，應(yīng)選用哪種固定相、流動相? 為什么?
解：鄰氨基苯酚中微量雜質(zhì)苯氨測定，為了良好分離，應(yīng)讓苯氨先出峰，由于苯氨的極性小于鄰氨基苯酚，因此應(yīng)采用正相色譜法，應(yīng)選硅膠為固定相，異丙醚—己烷為流動相。
27、在ODS鍵合固定相，甲醇—水為流動相時試判斷四種苯并二氮雜苯的出峰順序。為什么?
解：色譜條件為反相鍵合色譜體系，在反相色譜體系中極性大的組分k小，首先出峰，按四種苯并二氮雜苯的結(jié)構(gòu)，出蜂順序為4—3—2—1。
28、用多孔凝膠為固定相，流動相為四氫呋喃，分離以下各組分，試判斷各組分的出蜂順序。為什么?
解：凝膠色譜組分的出峰次序是根據(jù)分子尺寸大小，大的先出峰.故出峰次數(shù)為n=9、8、7。
29、分離含胺類和季銨接的樣品，以0.2M HClO4溶液為固定相，以丁醇—二氯甲烷—己烷為流動相，已知組分A的保留時間為8.2min，死時間為1.0min.在另一根柱上.其他條件均不改變，只將HClO4的濃度增加一倍，間組分A在第二根柱上的移動速率，是在第一根柱上的幾倍?
解：從題意分析知，該題分離類型是正相離子對色譜，因此K與KBP的關(guān)系為： A在第二根柱上的移動速率是第一根柱的1.78倍。
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