液相色譜的保養(yǎng)小技巧
液相色譜組成部分：流動(dòng)相溶劑瓶→高壓泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→廢液。
我們按照此順序來(lái)一一說(shuō)明如何做保養(yǎng)?
一、流動(dòng)相溶劑瓶的保養(yǎng)
溶劑瓶是流動(dòng)相的起點(diǎn)，通常是盛放水相溶液或是有機(jī)相溶液。
1. 水相溶液 對(duì)于水相溶液來(lái)說(shuō)，首要的問(wèn)題是防止污染。對(duì)于溶劑瓶我們要做的非常重要的工作就是勤換流動(dòng)相，常換常新。
2. 有機(jī)相溶液 對(duì)于有機(jī)相溶液，可以不用擔(dān)心細(xì)菌繁殖的問(wèn)題。但是有機(jī)相容易發(fā)生聚合，特別是乙腈在適宜的光照條件下極易發(fā)生聚合，瓶子里就會(huì)出現(xiàn)一些絮狀的聚合沉淀物。為了防止聚合過(guò)程的發(fā)生，裝乙腈時(shí)要用棕色的溶劑瓶，避免陽(yáng)光直射，更換乙腈時(shí)應(yīng)當(dāng)棄去瓶底剩余的溶液。
3. 清洗過(guò)濾 溶劑瓶里的過(guò)濾頭，其作用是為了防止溶液瓶中的顆粒雜質(zhì)進(jìn)入到儀器的流路系統(tǒng)中，它的材質(zhì)通常分為玻璃燒結(jié)石英和不銹鋼，如果不慎堵塞會(huì)造成流動(dòng)相吸液不暢，因此必須進(jìn)行清洗，玻璃材質(zhì)的通常是用稀硝酸泡，而不銹鋼材質(zhì)的可以直接進(jìn)行超聲清洗。
二、高壓泵的保養(yǎng)
泵是液相色譜的核心，泵將流動(dòng)相從溶劑瓶輸送到液相流路系統(tǒng)中，并要在高壓下保持流量和壓力的穩(wěn)定。狀態(tài)正常的高壓泵是液相色譜準(zhǔn)確分析的基礎(chǔ)，所以平日一定要重視對(duì)泵的維護(hù)。
1. 泵壓力波動(dòng) 很多情況下，泵的問(wèn)題反映在壓力上，壓力波動(dòng)又是常見(jiàn)的一類問(wèn)題。通常我們可以通過(guò)重新清洗流路和再次脫氣流動(dòng)相加以解決。
2. 過(guò)濾白頭保養(yǎng) 在泵的維護(hù)里還有一項(xiàng)常做的工作就是更換清洗閥上的過(guò)濾白頭，通常判斷的標(biāo)準(zhǔn)是純水以5 mL/min流速清洗的時(shí)候，如果壓力超過(guò)1 MPa則考慮更換。
三、進(jìn)樣器的保養(yǎng)
進(jìn)樣器分手動(dòng)和自動(dòng)兩大類，雖然兩者工作模式不同，但使用的要點(diǎn)是基本一致的。
1. 防止交叉污染 自動(dòng)進(jìn)樣器常見(jiàn)的問(wèn)題是交叉污染，交叉污染產(chǎn)生的原因很直接，樣品殘留在進(jìn)樣針內(nèi)外表面，并隨下一次進(jìn)樣進(jìn)入色譜系統(tǒng)。要解決交叉污染，主要靠清洗。
2. 精細(xì)操作 手動(dòng)進(jìn)樣器的操作要點(diǎn)大致相同，應(yīng)使用液相色譜LC專用進(jìn)樣針，進(jìn)樣時(shí)插針應(yīng)插到底，不使用時(shí)將針頭留在進(jìn)樣器內(nèi)，使用前后都要及時(shí)清洗。
四、色譜柱的保養(yǎng)
色譜柱是化合物分離的關(guān)鍵。保養(yǎng)良好的色譜柱具有更長(zhǎng)的使用壽命，且儀器基線平穩(wěn)。
1. 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng) 溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩(如前所述)。
2. 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成 特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?/p>
3. 色譜柱反沖 納譜分析小分子分離液相色譜柱ChromCore系列和EcoPak系列色譜柱可以反沖;納譜分析手性色譜柱UniChiral系列色譜柱可以反沖，反沖可以除去留在柱頭的雜質(zhì)。但是納譜分析生物大分子液相色譜柱BioCore系列色譜柱不要反沖，否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
4. 選擇使用適宜的流動(dòng)相(尤其是pH)以避免固定相被破壞。
5. 避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi) 需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
6. 經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì) 在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75 ml。
反相柱清洗再生程序：
第一步：50%去離子水/50%甲醇或乙腈(5倍柱體積)
第二步：80%去離子水/20%甲醇或乙腈(5倍柱體積)
第三步：80%(含0.1%EDTA水溶液)/20%甲醇或乙腈(10倍柱體積)
第四步：80%去離子水/20%甲醇或乙腈(5倍柱體積)
第五步：100%甲醇或乙腈(5倍柱體積)
第六步：100%異丙醇(10倍柱體積)
第七步：100%甲醇或乙腈(5倍柱體積)
正相柱/HILIC色譜柱清洗再生程序：
第一步：50% 0.1 M醋酸銨，pH5/50%乙腈(5倍柱體積)
第二步：100% 0.1 M醋酸銨，pH5(5倍柱體積)
第三步：50% 0.1 M醋酸銨，pH5/50%乙腈(5倍柱體積)
第四步：100%乙腈(10倍柱體積)
第五步：100%異丙醇(10倍柱體積)
第六步：100%乙腈(5倍柱體積)
第七步：使用前用20倍柱體積的流動(dòng)相平衡色譜柱
陽(yáng)離子交換柱清洗再生程序：
第一步：0.1% 乙酸(5倍柱體積)
第二步：0.3M磷酸鹽緩沖液，含0.1% 乙二胺四乙酸(pH7，至少20倍柱體積)
第三步：0.1% 乙酸(10倍柱體積)
第四步：乙腈(5倍柱體積)
第五步：異丙醇(至少20倍柱體積)
第六步：乙腈(5倍柱體積，封存)
陰離子交換柱清洗再生程序：
第一步：0.1% 乙酸(5倍柱體積)
第二步：0.3M磷酸鹽緩沖液，含0.1% 乙二胺四乙酸(pH7，至少20倍柱體積)
第三步：0.1% 乙酸(10倍柱體積)
第四步：乙腈(5倍柱體積)
第五步：異丙醇(至少20倍柱體積)
第六步：乙腈(5倍柱體積，封存)
7. 保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)晚上或更長(zhǎng)時(shí)間。
8. 色譜柱使用過(guò)程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。
在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開(kāi)柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2 mm高度(注意把被污染填料取凈)再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤(rùn)的固定相(與柱內(nèi)相同)填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5~30 mm)，可以起到保護(hù)、延長(zhǎng)柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效，這是值得的。
通常以硅膠為基質(zhì)的色譜柱，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時(shí)間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂。新的色譜柱在使用一段時(shí)間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)。
每次工作完后，用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應(yīng)用無(wú)鹽流動(dòng)相沖洗。含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道，不宜長(zhǎng)期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4~5天開(kāi)機(jī)沖洗15分鐘。
五、檢測(cè)器的保養(yǎng)
1. 光源部分
檢測(cè)器中非常重要的部件是光源，光源對(duì)發(fā)射能量有要求，一旦能量衰減到一定程度，就會(huì)出現(xiàn)基線噪聲變大，靈敏度降低等一系列影響使用的問(wèn)題，因此光源是一個(gè)消耗品。通常紫外燈的壽命是2000 h，當(dāng)?shù)竭_(dá)這個(gè)時(shí)限的時(shí)候，我們就要特別關(guān)注燈的能量狀況，可以通過(guò)儀器維護(hù)軟件中自帶的“燈能量測(cè)試”功能來(lái)判斷，測(cè)試的結(jié)果會(huì)分別評(píng)估低、中、高三個(gè)波長(zhǎng)段的能量，一旦某個(gè)波長(zhǎng)段的測(cè)試結(jié)果顯示失敗，就表示需要更換燈。
2. 檢測(cè)池
檢測(cè)器中另一個(gè)重要部件是檢測(cè)池，也叫流通池。通常大家關(guān)心的一個(gè)問(wèn)題是檢測(cè)池被堵掉，因?yàn)闄z測(cè)池通常不是很耐壓，所以一旦被堵就很可能造成損壞。事實(shí)上檢測(cè)池通常不太容易被堵，原因是幾乎所有的顆粒雜質(zhì)都會(huì)被色譜柱攔下了，所以堵塞檢測(cè)器的東西基本都不是來(lái)自樣品的，很可能是后來(lái)“產(chǎn)生”的，比如含鹽流動(dòng)相殘留在檢測(cè)池中導(dǎo)致鹽析出。
六、廢液的處置
液相色譜儀LC的廢液大部分含有有機(jī)溶劑，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的危害，對(duì)環(huán)境也會(huì)產(chǎn)生污染，嚴(yán)禁隨意傾倒，應(yīng)及時(shí)處理。目前，國(guó)內(nèi)大部分實(shí)驗(yàn)室是將廢液送到專門的廢液處理站集中進(jìn)行無(wú)害化處理。
