【行業(yè)新聞】質(zhì)譜是怎樣做到定量的？

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時(shí)間：2017-09-28 12:05

注：這里的定量指的是待分析物的含量質(zhì)譜可以通過分子量信息定性（結(jié)構(gòu)），但根據(jù)我的理解，質(zhì)譜信號(hào)的強(qiáng)度是和離子化難易相關(guān)，并不能反應(yīng)待分析物的含量（定量）

作者：胡墨

　　1. 質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度與待分析物含量的關(guān)系

任何定量分析方法都需要建立實(shí)驗(yàn)測(cè)量信號(hào)與待分析物的量的關(guān)系。很幸運(yùn)的是，在質(zhì)譜中，通常也可以建立這樣的關(guān)系，因此質(zhì)譜信號(hào)是可以用于定量的。從題主的說明來看，Ta的疑惑主要在這里。既然問題是“質(zhì)譜是怎樣做到定量的？”，我們不妨把質(zhì)譜信號(hào)的產(chǎn)生按時(shí)間順序粗略分為三個(gè)步驟，即離子的產(chǎn)生，傳輸與檢測(cè)。

產(chǎn)生離子時(shí)，不同樣品分子的電離通常是相互獨(dú)立的。因此樣品量越多，其產(chǎn)生的離子也就越多。目前常用的各種離子化方法（EI、ICP、ESI、MALDI等）在實(shí)驗(yàn)中（嚴(yán)格來說僅在一定濃度范圍內(nèi)——術(shù)語是動(dòng)態(tài)范圍，dynamic range）都至少滿足樣品量與產(chǎn)生離子量的正相關(guān)，一般情況下也可以進(jìn)一步近似成線性相關(guān)。

傳輸離子時(shí)，簡(jiǎn)單來說可以認(rèn)為傳輸效率與被傳輸離子的量無關(guān)；（嚴(yán)格地說，被傳輸?shù)碾x子太多時(shí)，相同電荷的互相排斥會(huì)造成離子束的“體積”變大，導(dǎo)致傳輸效率下降。這種影響在空間有限的離子阱中表現(xiàn)得更加明顯，因此在離子阱質(zhì)譜中一個(gè)重要的技術(shù)就是適當(dāng)控制進(jìn)入儀器的離子數(shù)量，使其既不太少也不太多。）

檢測(cè)離子時(shí)，不論是使用光電倍增管的檢測(cè)器，還是檢測(cè)鏡像電流的檢測(cè)器（ICR/Oribtrap），其信號(hào)強(qiáng)度（在一定范圍內(nèi)）均與離子數(shù)量大致線性相關(guān)。

廢話幾句，可能會(huì)使題主感覺質(zhì)譜不能定量的原因之一是，我們看到的質(zhì)譜圖常用相對(duì)強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)，即0-100%最強(qiáng)峰，而不展示信號(hào)的絕對(duì)強(qiáng)度。但在做質(zhì)譜的時(shí)候，儀器記錄的當(dāng)然是絕對(duì)強(qiáng)度（相對(duì)強(qiáng)度也是通過絕對(duì)強(qiáng)度換算出來的）。我們需要用絕對(duì)強(qiáng)度來定量時(shí)，就需要這部分平時(shí)不?？吹男畔⒘恕?/p>

另外，在談到色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法時(shí)，待分析物與實(shí)驗(yàn)測(cè)量信號(hào)的關(guān)系之中又多了一層色譜，即待分析物含量->色譜流出物中樣品含量->質(zhì)譜信號(hào)。與EI譜圖分析以相對(duì)強(qiáng)度為主不同，在色譜-質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)，信號(hào)的絕對(duì)強(qiáng)度就成了我們天天都要關(guān)心的內(nèi)容，因?yàn)橘|(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間的變化就是實(shí)驗(yàn)的色譜圖，通常以總離子強(qiáng)度或者某一特定質(zhì)荷比離子的強(qiáng)度作圖。

2. 定量的兩種方法

說過了為什么質(zhì)譜可以定量，下面我們來看看具體的定量方法。常用的定量方法有兩種，外標(biāo)法與內(nèi)標(biāo)法。

外標(biāo)法

用已知量的標(biāo)準(zhǔn)樣品A和未知量的待測(cè)樣品A分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；我們會(huì)得到以下三個(gè)信息：標(biāo)準(zhǔn)樣品的量（已知）；標(biāo)準(zhǔn)樣品的信號(hào)強(qiáng)度；待測(cè)樣品的信號(hào)強(qiáng)度。（假設(shè)樣品的響應(yīng)=常數(shù)*濃度，從這三個(gè)信息即可算出待測(cè)樣品的量。）

為了更加精確地測(cè)定未知量的樣品，我們希望標(biāo)準(zhǔn)樣品的信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)樣品的信號(hào)強(qiáng)度盡量接近（以減少非線性響應(yīng)的影響）。因此常用的外標(biāo)法會(huì)測(cè)量一系列已知量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，繪制一條工作曲線，再用擬合的方法確定未知樣的量。

內(nèi)標(biāo)法

外標(biāo)法主要有以下兩方面的局限：1標(biāo)樣和待測(cè)樣是獨(dú)立進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的，實(shí)驗(yàn)間的偶然誤差無法消除；2標(biāo)樣和待測(cè)樣的基質(zhì)（即除待分析物外的其它成分）不同，基質(zhì)有可能會(huì)帶來不同的影響，也會(huì)產(chǎn)生誤差。

那么，如果我們把已知量的標(biāo)準(zhǔn)樣品B直接加入待測(cè)樣品A，就可以把標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品的測(cè)定在同一次實(shí)驗(yàn)和同樣基質(zhì)中完成，也就消除了兩次實(shí)驗(yàn)和基質(zhì)不同造成的誤差，這就是內(nèi)標(biāo)法。（如果加入的標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品是同種物質(zhì)A，那么由于它們不可區(qū)分，只通過一次實(shí)驗(yàn)是不能定量待測(cè)樣的，這時(shí)我們?cè)诩尤霕?biāo)樣前后分別進(jìn)行兩次測(cè)量，即測(cè)量待測(cè)樣及待測(cè)樣+標(biāo)樣的信號(hào)，即可計(jì)算出待測(cè)樣的量。）

3. 質(zhì)譜相關(guān)的特殊定量細(xì)節(jié)

同位素稀釋

前面內(nèi)標(biāo)法的介紹中我們可以發(fā)現(xiàn)，最理想的內(nèi)標(biāo)物既要和待測(cè)樣相同（具有相同的響應(yīng)系數(shù)）又要不同（儀器可以區(qū)分二者的信號(hào)），這對(duì)矛盾的集合體就是同位素內(nèi)標(biāo)。

由于不同同位素的化合物具有近似相同的物理化學(xué)性質(zhì)，離子化時(shí)的響應(yīng)通常也是相同的，而它們具有不同的質(zhì)荷比m/z，即可在質(zhì)譜中被區(qū)分出來。因此同位素標(biāo)準(zhǔn)品是最理想的內(nèi)標(biāo)物。

另外，由于某些元素的天然同位素分布有一定的比例，當(dāng)我們加入一定量的同位素內(nèi)標(biāo)時(shí)，可以把對(duì)信號(hào)絕對(duì)強(qiáng)度的測(cè)量轉(zhuǎn)化為對(duì)信號(hào)相對(duì)比例的測(cè)量，從而提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)

在不太復(fù)雜的體系中，我們只要按照分子量就可以定性某種化合物了。但對(duì)于復(fù)雜混合物（如石油產(chǎn)品/生物樣品）而言，很多化合物具有相同或相近的質(zhì)量（同分異構(gòu)體質(zhì)量完全相同，有些化合物分子量非常接近，如CO和N2，要考慮儀器的質(zhì)量分辨率是否能區(qū)分二者），此時(shí)僅靠測(cè)量質(zhì)量就不能確定這個(gè)化合物是否就是我們關(guān)心的“the one”了。

在串聯(lián)質(zhì)譜 (Tandem MS) 儀器中，我們不僅可以把質(zhì)譜儀理解為一個(gè)稱量離子的“天平”，它還具有了離子“鑷子”（選擇某個(gè)特定的離子把它分離出來）和“剪刀”（把某個(gè)/某些離子激活并打成碎片）的功能。

通過母離子和子離子的兩步選擇，我們可以在復(fù)雜體系中精確定位到我們關(guān)心的化合物，同時(shí)，兩次離子選擇還可減少復(fù)雜基質(zhì)的干擾，降低背景噪聲（獲得更低的檢出限）并提高方法的動(dòng)態(tài)范圍。因此選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)是目前色譜（氣相色譜/液相色譜）-質(zhì)譜聯(lián)用中最常用的定量方法。

致謝和補(bǔ)充閱讀：第一幅圖是自己的數(shù)據(jù)；后面幾幅圖來自Wikipedia，CC BY-SA 3.0(Creative Commons)Wikipedia (英語): Standard curve, Isotope dilution, Selected reaction monitoring

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