[科研進(jìn)展]納米孔測(cè)序的過(guò)去、現(xiàn)在和將來(lái)
縱觀(guān)測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷程，沒(méi)有哪一個(gè)技術(shù)像納米孔測(cè)序那樣慢熱，但也沒(méi)有哪一個(gè)技術(shù)像納米孔測(cè)序這么接近普羅大眾。將單鏈DNA拉過(guò)蛋白孔，檢測(cè)堿基穿過(guò)時(shí)電導(dǎo)的微小改變，納米孔測(cè)序的這一基礎(chǔ)理念已經(jīng)有十幾年歷史了。
1996年哈佛大學(xué)的Daniel Branton、加州大學(xué)的David Deamer及其同事，在美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊PNAS雜志上首次發(fā)表文章指出，可以用膜通道檢測(cè)多核苷酸序列。然而從第一篇論文到納米孔測(cè)序的成形，這條道路并不是一帆風(fēng)順的。研究者們產(chǎn)生了很多分歧，也遇到了大量的技術(shù)死胡同。
一個(gè)平凡的開(kāi)始
利用納米孔進(jìn)行測(cè)序的理念是非常直觀(guān)的：讓DNA堿基一個(gè)個(gè)穿過(guò)納米孔，同時(shí)快速鑒定每一個(gè)堿基。然而真正實(shí)施起來(lái)人們卻遇到了很多問(wèn)題。如何在堿基穿過(guò)的時(shí)候進(jìn)行檢測(cè)?DNA鏈穿過(guò)納米孔時(shí)是否需要放慢速度?如何大量生成同樣大小的納米孔?
Deamer和Branton最初的想法是，給持續(xù)開(kāi)啟的通道施加跨膜電壓，把線(xiàn)性DNA或RNA鏈拉過(guò)納米孔。這一過(guò)程會(huì)立刻改變納米孔的離子流，對(duì)此加以檢測(cè)就可以確定DNA或RNA的構(gòu)成。然而，在這種情況下DNA穿過(guò)納米孔的速度太快，難以進(jìn)行有效檢測(cè)。
進(jìn)入二十一世紀(jì)之后，越來(lái)越多的研究者致力于解決這些問(wèn)題，讓納米孔測(cè)序成為現(xiàn)實(shí)?！翱梢哉f(shuō)是NIH的$1000基因組計(jì)劃刺激了納米孔測(cè)序的發(fā)展，”O(jiān)xford Nanpore公司的創(chuàng)始人之一，牛津大學(xué)的Hagan Bayley最近撰文指出。
人們開(kāi)始嘗試改良納米孔本身。天然的生物學(xué)通道(比如alpha-hemolysin)和開(kāi)口小于2nm的人工納米孔都可以用于納米孔測(cè)序。研究者們發(fā)現(xiàn)，雖然人工納米孔免去了和生物學(xué)材料打交道的麻煩，但大規(guī)模制造這么小的納米孔實(shí)在太困難。最終，蛋白通道成為了納米孔測(cè)序的主流。
真正實(shí)現(xiàn)商業(yè)化
2005年，Bayley、Gordon Sanghera和Spike Wilcocks創(chuàng)立的Oxford Nanopore公司正式登場(chǎng)。為了開(kāi)發(fā)穩(wěn)定可靠的納米孔測(cè)序平臺(tái)，該公司從2007年開(kāi)始研發(fā)以蛋白為基礎(chǔ)的納米孔測(cè)序系統(tǒng)。2012年，該公司在A(yíng)GBT(基因組生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展年會(huì))上發(fā)布了自己的納米孔系統(tǒng)——MinION。
MinION是首個(gè)U盤(pán)大小的納米孔測(cè)序儀，價(jià)格在一千美元作用，一天能生成約1Gb數(shù)據(jù)。該系統(tǒng)發(fā)布之后很快引起了轟動(dòng)，被許多人視為基因組測(cè)序的未來(lái)。然而直到2014年的AGBT，人們才首次看到MinION系統(tǒng)的實(shí)戰(zhàn)表現(xiàn)。
Broad研究所的David Jaffe在這次會(huì)議上展示了自己的MinION數(shù)據(jù)，他利用納米孔測(cè)序的長(zhǎng)讀取來(lái)組裝細(xì)菌基因組。研究顯示，這個(gè)平臺(tái)的平均讀長(zhǎng)大約在5kb左右，最長(zhǎng)能達(dá)到20kb。對(duì)于這么小的裝置來(lái)說(shuō)，這種測(cè)序能力是相當(dāng)令人震撼的。雖然MinION的總體序列質(zhì)量和錯(cuò)誤率受到了一些質(zhì)疑，但仍然有很多研究者希望嘗試這種迷你測(cè)序儀。
這一次，人們并沒(méi)有等太久。2014年Oxford Nanopore公司啟動(dòng)了先期體驗(yàn)項(xiàng)目，研究者只需要提供一千美元的押金和相應(yīng)的運(yùn)費(fèi)，就可以獲得測(cè)序設(shè)備和一次性的流動(dòng)槽，在自己的項(xiàng)目中嘗試MinION系統(tǒng)。
2015年初，先期體驗(yàn)項(xiàng)目的數(shù)據(jù)陸續(xù)發(fā)布出來(lái)。三月份，Exeter大學(xué)的研究人員在Biomolecular Detection and Quantification雜志上發(fā)表文章，對(duì)MinION系統(tǒng)性能進(jìn)行了評(píng)估。文章寫(xiě)到“作為首個(gè)基于納米孔的商業(yè)化單分子測(cè)序儀，MinION是很有前景的。然而，目前的錯(cuò)誤率限制了它與現(xiàn)有測(cè)序技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)的能力。不過(guò)我們發(fā)現(xiàn)，MinION與Illumina MiSeq數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái)使用，有助于de novo基因組裝配。”
七月份，一個(gè)瑞典研究團(tuán)隊(duì)用MinION建立了細(xì)菌基因組草圖。研究表明，這一系統(tǒng)生成了能定位的長(zhǎng)讀取，精確度達(dá)到79%。作者們總結(jié)道，“隨著進(jìn)一步的技術(shù)發(fā)展，我們相信MinION不僅可用于基因組裝配，也能用于實(shí)地的快速檢測(cè)?！贝送?，還有研究者用MinION對(duì)綠膿桿菌和大腸桿菌E.coli進(jìn)行了測(cè)序。
高通量就在前方
納米孔測(cè)序目前還處于發(fā)展初期。除了解決錯(cuò)誤率問(wèn)題，平行測(cè)序能力對(duì)于這一技術(shù)的推廣也很重要。問(wèn)題是，怎樣才能同時(shí)評(píng)估成千上萬(wàn)個(gè)納米孔的離子流改變。
八月份，Hagan Bayley和牛津大學(xué)的研究人員在這方面取得了突破性進(jìn)展。他們開(kāi)發(fā)的光傳感納米孔芯片，能夠同時(shí)檢測(cè)大量的納米孔。檢測(cè)方法的改變是這項(xiàng)研究的關(guān)鍵所在。Bayley等人將納米孔的離子流變化轉(zhuǎn)化為可以直接觀(guān)測(cè)到的熒光改變，并在多種蛋白納米孔(包括alpha-hemolysin)中展示了這一技術(shù)的可行性。這一技術(shù)為大規(guī)模納米孔測(cè)序平臺(tái)奠定了基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)：
1. Kasianowicz J.J., Brandin, E., Branton, D., and Deamer, D.W. 1996. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 93(24): 13770-13773.
2. Laver, T. et al. 2015. Assessing the performance of the Oxford Nanopore Technologies MinION. Biomolecular Detection and Quantification, Vol 3, pg 1-8.
3. Karlsson, A et al. 2015. Scaffolding of a bacterial genome using MinION nanopore sequencing. Scientific Reports, doi: 10.138/srep11996
4. Huang S. et al. 2015. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array. Nature Nanotechnology. doi: 10.1038/nnano.2015.189
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